Diferencia en el uso de receptores entre el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el coronavirus de origen murciélago similar al SARS

Diferencia en el uso de receptores entre el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y el coronavirus de origen murciélago similar al SARS

 

Wuze Ren / Xiuxia Qu / Wendong Li / Zhenggang Han / Meng Yu / Peng Zhou / Shu-Yi Zhang / Lin-Fa Wang / Hongkui Deng / Zhengli Shi

 

Resumen

El síndrome respiratorio agudo severo (SARS, por sus siglas en inglés) es causado por el coronavirus asociado al SARS (SARS-CoV), que usa la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) como su receptor para la entrada celular. Se ha identificado un grupo de CoV similares al SRAS (SL-CoV) en murciélagos de herradura. Los SL-CoV y los SARS-CoV comparten organizaciones genómicas idénticas e identidades de secuencia alta, con la principal excepción del extremo N de la proteína de pico (S), que se sabe que es responsable de la unión del receptor en los CoV. En este estudio, investigamos el uso del receptor de SL-CoV S mediante la combinación de un sistema de pseudovirus basado en el virus de la inmunodeficiencia humana con líneas celulares que expresan las moléculas ACE2 de murciélago humano, algalia o herradura. Además de la S de longitud completa de SL-CoV y SARS-CoV, se construyó una serie de quimeras S insertando diferentes secuencias de SARS-CoV S en la columna vertebral de SL-CoV S. Se hicieron varias observaciones importantes a partir de este estudio. Primero, el SL-CoV S no pudo utilizar ninguna de las tres moléculas ACE2 como su receptor. En segundo lugar, el SARS-CoV S no pudo entrar en las células que expresaban el murciélago ACE2. En tercer lugar, el S quimérico que cubre el dominio de unión al receptor definido previamente ganó su capacidad para ingresar a las células a través de ACE2 humana, aunque con diferentes eficiencias para diferentes construcciones. En cuarto lugar, se encontró que una región de inserción mínima (aminoácidos 310 a 518) era suficiente para convertir el SL-CoV S de la unión sin ACE2 a la unión de ACE2 humana, lo que indica que el SL-CoV S es en gran medida compatible con la proteína S del SARS-CoV, tanto en estructura como en función. Se discute la importancia de estos hallazgos en relación con el origen del virus, la recombinación del virus y el cambio de hospedador.

Los brotes de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) en 2002-2003, que resultaron en más de 8.000 infecciones y cerca de 800 muertes, fueron causados ​​por un nuevo coronavirus (CoV), ahora conocido como CoV asociado al SARS (SARS-CoV). (12, 25, 33, 36). La asociación de SARS-CoV con animales fue revelada por primera vez por el aislamiento e identificación de virus muy relacionados en varias civetas de palma del Himalaya (Paguma larvata) y un perro mapache (Nyctereutes procyonoides) en un mercado de animales vivos en Guangdong, China. Existe una identidad de secuencia genómica muy alta (más del 99%) entre el virus similar al SARS-CoV de las civetas y el SARS-CoV de los seres humanos, lo que respalda la idea de que el SARS-CoV es de origen animal (18). Sin embargo, estudios posteriores mostraron que las civetas de palma en granjas y en el campo estaban en gran parte libres de infección por SARS-CoV (23, 40). Estos resultados sugirieron que las civetas de las palmeras desempeñaban un papel como hospedante intermedio más que como reservorio natural. Estudios de vigilancia posteriores entre diferentes poblaciones de murciélagos revelaron la presencia en varias especies de murciélagos de herradura (género Rhinolophus) de un grupo diverso de CoV, que son muy similares al SARS-CoV en la organización y secuencia del genoma. Estos virus se denominan CoV similares al SARS (SL-CoV) o virus similares al SARS-CoV (26, 29). Dichos descubrimientos plantearon la posibilidad de que los murciélagos sean los reservorios naturales del SARS-CoV (26, 29, 38) y desencadenaron un aumento en la búsqueda de CoV en diferentes especies de murciélagos en diferentes ubicaciones geográficas (39, 43, 44a).

El análisis filogenético basado en diferentes secuencias de proteínas sugirió que los SL-CoV que se encuentran en murciélagos y el SARS-CoV de humanos y civetas deben colocarse en un subgrupo separado (grupo b) en el grupo 2 de CoV (G2b) para diferenciarlos de otros CoV del grupo 2 en el género Coronavirus (17, 26, 29, 43). Las CoV de G2b muestran diferencias de secuencia importantes en las regiones N-terminales de sus proteínas S. Las proteínas S de los CoV desempeñan un papel clave en la entrada del virus en las células huésped, incluida la unión a los receptores de la célula huésped y la fusión de membranas (4, 10, 24). La enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) ha sido identificada como el receptor funcional del SARS-CoV, y la interacción molecular entre ACE2 y la proteína S del SARS-CoV ha sido bien caracterizada (27, 28, 31, 42). Se demostró que un fragmento de 193 residuos (aminoácidos [aa] 318 a 510) en la proteína SARS-CoV S era el dominio de unión al receptor mínimo (RBD) que por sí solo era capaz de unirse eficazmente a ACE2 (1, 42a, 45 ). Además, se demostró que cambios menores en los residuos de aminoácidos del motivo de unión al receptor (RBM) de la proteína SARS-CoV S podrían abolir la entrada de SARS-CoV en las células que expresan ACE2 humano (huACE2) (7, 31). En la región RBD correspondiente de las proteínas SL-CoV S, existe una divergencia significativa de secuencia de las de las proteínas SARS-CoV S, incluidas dos deleciones de 5 y 12 o 13 aa. A partir del análisis cristalino-estructural del complejo S-ACE2, se predijo que es poco probable que la proteína S de SL-CoV use huACE2 como receptor de entrada (30), aunque esto nunca se ha probado experimentalmente debido a la falta de SL vivo -Aislados de CoV. También se desconoce si es posible construir una proteína SL-CoV S de unión a ACE2 reemplazando el RBD con el de las proteínas SARS-CoV S.

En este estudio, se empleó un sistema de pseudovirus basado en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) para abordar estos problemas. Nuestros resultados indicaron que la proteína SL-CoV S no puede usar proteínas ACE2 de diferentes especies para la entrada celular y que la proteína SARS-CoV S tampoco pudo unirse a la molécula ACE2 del murciélago en herradura, Rhinolophus pearsonii. Sin embargo, cuando el RBD de SL-CoV S fue reemplazado por el de SARS-CoV S, la proteína S híbrida pudo usar el huACE2 para la entrada celular, lo que implica que las proteínas SL-CoV S son estructural y funcionalmente muy similares al SARS-CoV S. Estos resultados sugieren que aunque es poco probable que los SL-CoV descubiertos en murciélagos infecten a los seres humanos utilizando ACE2 como receptor, queda por ver si son capaces de utilizar otras moléculas de superficie de ciertos tipos de células humanas para ganar la entrada. También es concebible que estos virus puedan volverse infecciosos para los humanos si experimentan una variación de secuencia N-terminal, por ejemplo, mediante recombinación con otros CoV, lo que a su vez podría conducir a una interacción productiva con ACE2 u otras proteínas de superficie en células humanas.

 

Materiales y métodos

Líneas celulares y anticuerpos.

Las líneas celulares humanas 293T y HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero de ternero fetal al 10% (Gibco). El anticuerpo policlonal de cabra contra el ectodominio huACE2 se adquirió de R&D Systems. El anticuerpo monoclonal (MAb) F26G8, que reconoció un epítopo lineal (aa 615 a 620 de la proteína S del SARS-CoV) conservado en todas las proteínas S conocidas de los SARS-CoV y SL-CoV (M. Yu, resultados no publicados), fue amablemente proporcionado por Jody Berry (3). El grupo de VIH del Instituto de Virología de Wuhan generó un MAb contra p24 del VIH (resultados no publicados). Se generaron anticuerpos policlonales de conejo contra ACE2 del murciélago R. pearsonii (RpACE2) utilizando una proteína RpACE2 recombinante expresada en Escherichia coli en nuestro laboratorio en el Instituto de Virología de Wuhan, siguiendo procedimientos estándar. Se adquirieron anticuerpos anti-inmunoglobulina G (IgG) de cabra anti-ratón conjugados con fosfatasa alcalina (AP) de Santa Cruz Biotechnology, IgG anti-conejo de cabra conjugado con AP de Chemicon (Australia), mezcla de proteína A / G conjugada con AP de Pierce, e IgG anti-cabra de burro conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) de PTGLab (Chicago, IL).

 

Construcción de plásmidos de expresión.

La construcción de un gen de proteína pico (S) con codón optimizado de SARS-CoV BJ01 (BJ01-S) en pcDNA3.1 (+) se describió previamente (34, 46). El gen S de longitud completa de un murciélago SL-CoV (Rp3) se clonó mediante amplificación por PCR a partir de ADNc preparado utilizando muestras fecales de un murciélago de R. pearsonii positivo para SL-CoV (29). Después de la optimización de codones para los primeros 400 aa en el extremo N, el gen S modificado se clonó en pcDNA3.1 (+). Para la introducción de la RBM de SARS-CoV S en SL-CoV S, se usó la región codificante de aa 424 a 494 de BJ01-S para reemplazar las regiones correspondientes de Rp3-S, dando como resultado un gen S (CS) quimérico designado CS424-494. Utilizando la misma estrategia, se construyó una serie de genes CS con secuencias BJ01-S mediante sustitución escalonada. Para facilitar la construcción de quimeras S, se introdujo una mutación puntual (A a G) en el nucleótido 1825 (el residuo A del codón ATG se denominó nucleótido 1) para generar un sitio EcoRI único en el marco de lectura abierto S. La quimera CS424-494 se confirmó mediante secuenciación completa para garantizar que no se introdujera ninguna mutación inesperada durante los procesos de PCR. Para otras quimeras construidas usando CS424-494 como plásmido donante, solo las secuencias recién insertadas entre los sitios BamHI (en el extremo 5') y EcoRI (en el nucleótido 1825) se confirmaron mediante secuenciación directa. La numeración de aminoácidos de BJ01-S se utilizó para todas las construcciones quiméricas en este estudio.

 

Clonación de genes ACE2 y establecimiento de líneas celulares que expresan ACE2.

La región codificante del homólogo de ACE2 en el murciélago de herradura R. pearsonii se obtuvo del intestino de un murciélago infectado con SL-CoV mediante PCR utilizando los siguientes cebadores: 5'-CGGATCCGCCACCATGTCAGGCTCTTTCTGGC-3' (cebador aguas arriba que contiene un sitio BamHI [subrayado]) y 5'-CGTCGACCTAAAAGGAGGTCTGAACATCATCA-3' (cebador aguas abajo con un sitio SalI [subrayado]). Las líneas celulares que expresan las proteínas huACE2 y palm civet (pcACE2) se establecieron en un estudio anterior (37). La región codificante de bat ACE2 se clonó en un vector retroviral, pBabe puro, y luego se transdujo en células HeLa para generar líneas celulares estables que expresan bat ACE2 siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente (37). La expresión estable de ACE2 en las células HeLa transducidas se confirmó mediante Western blot, inmunofluorescencia y ensayos de actividad de ACE2. 

 

Construcción y purificación de pseudovirus.

Los pseudovirus basados ​​en el VIH se prepararon como se describió anteriormente (37). En resumen, se cotransfectaron 12 μg de pHIV-Luc (pNL4.3.Luc.R-E-Luc) y los plásmidos que expresan S (o vector de control vacío) en 2 x 106 células 293T en placas de 10 cm. Después de 8 h, el medio se reemplazó con medio fresco. Los sobrenadantes se recogieron a las 48 h posteriores a la transfección, se aclararon de los restos celulares mediante centrifugación a 3000 × gy se filtraron a través de un filtro de tamaño de poro de 0,45 μm (Millipore). Los pseudovirus en el sobrenadante celular (4 ml) se purificaron mediante ultracentrifugación a través de una almohadilla de sacarosa al 20% (4 ml) a 55.000 xg durante 60 min usando un rotor Ty90 (Beckman). Los pseudovirus sedimentados se disolvieron en 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se almacenaron a -80° C en alícuotas hasta su uso. Para evaluar la incorporación de proteínas S y p24 del VIH en los virus pseudotipados, se sometieron 20 μl de virus purificados a electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y transferencia Western como se detalla a continuación.

 

Análisis de la expresión de la proteína S y del empaquetamiento de pseudovirus mediante Western blot.

Los lisados ​​de células 293T y HeLa o pseudoviriones sedimentados se separaron mediante SDS-PAGE (usando geles al 8%), seguido de transferencia a una membrana de nitrocelulosa (Millipore). Para el Western blot, la incubación con diferentes anticuerpos se realizó a temperatura ambiente durante 1 h. Para la detección de la expresión de S, la membrana se incubó con MAb F26G8 (1: 1.000) y los anticuerpos unidos se detectaron utilizando IgG anti-ratón de cabra conjugado con AP, también diluido a 1:1.000. Para detectar p24 de VIH en pseudovirus, se utilizó un MAb contra p24 de VIH (MAb p24) como primer anticuerpo a una dilución de 1:1.000, seguido del mismo anticuerpo conjugado con AP descrito anteriormente. La expresión de ACE2 en células HeLa se detectó usando el anticuerpo de cabra contra el ectodominio huACE2 (1:500) o el anticuerpo de conejo contra RpACE2 de murciélago (1:100) como anticuerpo primario, seguido de incubación con la proteína A conjugada con AP / G mezcla (1:1.000) o IgG anti-conejo de cabra conjugado con AP (1:1.000).

 

Examen de viriones de pseudovirus por EM.

Se cultivaron células HeLa de control y que expresaban ACE2 en cubreobjetos en placas de 24 pocillos (Costar, Corning, NY). Al día siguiente, las células se lavaron con PBS y se fijaron con formaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) durante 30 min a 4 ° C, seguido de incubación durante la noche con anticuerpo anti-huACE2 de cabra (dilución 1:150 en PBS) a 4° C. Al día siguiente, se llevó a cabo la incubación con IgG anti-cabra de burro conjugado con FITC (a una dilución 1:100 en PBS) a temperatura ambiente durante 30 min. Para la tinción nuclear, las células se incubaron con Hoechst 33258 durante 5 min a temperatura ambiente. A cada paso de incubación le siguió un lavado con PBS cinco veces. Después del lavado final, los portaobjetos se montaron con glicerol al 50% y se observaron con un microscopio confocal Leica (Leica, Alemania).

 

Ensayo de actividad ACE2.

La fracción de membrana celular se preparó como se describió anteriormente (11). Brevemente, las células HeLa (con o sin expresión de ACE2) se recogieron mediante centrifugación a 10.000 xg durante 5 min. El sedimento celular se lavó con PBS enfriado con hielo y se suspendió en solución salina tamponada con Tris (TBS) (Tris 100 mM y NaCl 500 mM, pH 6,5). Las células se sometieron a tres ciclos de congelación/descongelación, seguidos de una breve sonicación en hielo. El lisado celular se centrifugó a 15.000 xg durante 30 min y el sobrenadante se tomó como la fracción de proteína soluble. El sedimento, que contenía la fracción de membrana, se lavó con TBS enfriado con hielo y se volvió a centrifugar como se describió anteriormente. Después de la resuspensión en TBS, se determinó el contenido de proteína total tanto de la membrana como de las fracciones solubles con un BCA Protein Assay Kit (Chenergy Biocolor, China) usando albúmina de suero bovino como estándar. La actividad del ensayo de ACE2 se determinó según lo descrito por Douglas et al. (11) usando el sustrato fluorescente desactivado específico de ACE2 QFS (7-metoxicumarin-4-il) -acetil-Ala-Pro-Lys (2,4-dinitrofenilo), adquirido de Auspep (Melbourne, Australia). Los ensayos se realizaron en placas negras de 96 pocillos con QFS 50 µM por reacción. Se midió la fluorescencia liberada (en unidades de fluorescencia relativa) después de la incubación a 37ºC durante 1 hora a 320 a 420 nm. Para demostrar la inhibición específica, también se determinó la actividad de ACE2 en presencia de EDTA 0,1 mM.

 

Ensayo de infectividad e infección por pseudovirus.

Se sembraron células HeLa que expresan huACE2, pcACE2 o bat RpACE2 en una placa de 96 pocillos a 1 x 104 células/pocillo 1 día antes de la infección. Para la infección, se añadieron a las células 4 µl de pseudovirus purificados mezclados con 96 µl de medio que contenía 8 µg / ml de polibreno. La mezcla se retiró y se reemplazó con medio nuevo de 8 a 12 h después de la infección (p.i.). La infección se controló midiendo la actividad de luciferasa, expresada a partir del gen indicador portado por el pseudovirus, utilizando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Brevemente, las células se lisaron a las 48 h p.i. mediante la adición de 20 µl de tampón de lisis proporcionado con el kit, y se ensayó la actividad luciferasa de 10 µl de los lisados ​​resultantes mediante la adición de 50 µl de sustrato de luciferasa en un luminómetro Turner Designs TD-20/20. Cada experimento de infección se realizó por triplicado y todos los experimentos se repitieron tres veces.

 

Número de acceso a GenBank.

La secuencia de la región codificante de R. pearsonii ACE2 se ha depositado en GenBank con el número de acceso EF569964.

 

Resultados

Clonación de bat ACE2 y su expresión funcional en células HeLa.

El homólogo del gen ACE2 amplificado a partir del murciélago de herradura R. pearsonii (RpACE2) codifica una proteína 805-aa que es idéntica en tamaño a las proteínas ACE2 de humanos y civetas. La alineación de la secuencia indicó que la molécula de murciélago RpACE2 es similar a las proteínas ACE2 de otros mamíferos y tiene una identidad de secuencia de aminoácidos del 81% con huACE2 y pcACE2 y del 77% con las proteínas ACE2 de ratón y rata. Como se muestra en la Fig. 1, la variación de secuencia principal se encuentra en la región N-terminal. Para los 18 residuos de huACE2 que se sabe que hacen contacto directo con la proteína SARS-CoV S (27), hay siete cambios en RpACE2 en comparación con la proteína humana afín: Q24R (Q en huACE2 y R en RpACE2 en aa 24), Y41H , Q42E, M82D, Q325E, E329N y G354D (figura 1).

Se estableció una línea celular HeLa estable que expresó continuamente la proteína bat RpACE2. El análisis de transferencia Western mostró que RpACE2 se expresaba eficazmente en células HeLa y era reconocido por anticuerpos anti-RpACE2 (Fig. 2). Además, huACE2 y pcACE2 también podrían ser reconocidos por anticuerpos anti-RpACE2. Los niveles de expresión de las tres moléculas diferentes de ACE2 fueron muy similares. En SDS-PAGE, RpACE2 tiene una movilidad muy similar a la de las otras dos proteínas ACE2, con una masa aparente de aproximadamente 90 a 100 kDa, que está dentro del rango de tamaño de la masa predicha de 93 kDa.

La localización de ACE2 expresada en la superficie celular se demostró mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia usando un anticuerpo comercial generado contra el ectodominio de huACE2 (Fig. 3). La ubicación de la superficie, así como la funcionalidad de ACE2, se evaluó adicionalmente mediante un ensayo de actividad enzimática utilizando un sustrato peptídico específico de ACE2, QFS. Como se muestra en la Fig. 4, las fracciones de membrana preparadas a partir de tres líneas de células HeLa que expresan ACE2 mostraron actividades de proteasa sustancialmente más altas hacia QFS que las células HeLa de control. Además, la actividad de la proteasa se abolió en gran medida en presencia de EDTA 0,1 mM, un inhibidor conocido de las proteasas ACE2 (11). Estos datos indicaron que las tres moléculas de ACE2 se expresaron como una proteasa funcional asociada con las membranas celulares.

 

Envasado de pseudovirus.

La expresión de proteínas S funcionales y su correcta incorporación en pseudovirus se controlaron mediante tres enfoques, es decir, transferencia Western de lisados ​​celulares con un MAb específico de S, transferencia Western de viriones sedimentados utilizando MAbs específicos de S y específicos de p24, y directa examen de viriones por EM. Los resultados se resumen en la Fig. 5. Los genes BJ01-S y Rp3-S se expresaron eficazmente en células 293T transfectadas, y las proteínas S expresadas se incorporaron en los pseudovirus respectivos como se esperaba (Fig. 5A). Cuando se examinó mediante EM, los pseudovirus que contienen la proteína Rp3-S o BJ01-S mostraron una morfología característica de CoV (Fig. 5B). Por otro lado, se obtuvieron resultados contrastantes para dos proteínas CS. Para CS14-608, la proteína S expresada se incorporó al pseudovirus, como se observó para las otras dos construcciones no quiméricas. Sin embargo, para CS424-494, aunque la expresión de la proteína S era normal, el pseudovirus parecía incapaz de ensamblar la proteína CS a un nivel detectable por análisis de transferencia de Western (Fig. y el montaje pareció normal (Fig. 5A).

 

Uso de huACE2, pcACE2 y bat RpACE2 para la entrada celular de diferentes pseudovirus.

Cuando se utilizó pseudovirus VIH/Rp3-S para infectar células HeLa que expresan huACE2, pcACE2 o RpACE2, solo se obtuvo un nivel bajo de actividad luciferasa (aproximadamente 100 unidades de luz relativa, el mismo que el nivel de fondo generado por el control del vector) (Figura 6). Por el contrario, cuando se utilizó el pseudovirus del tipo BJ01-S, se detectaron altos niveles de actividad luciferasa (más de 105 unidades de luz relativas) en los lisados ​​celulares de HeLa-huACE2 y HeLa-pcACE2 (Fig. 6A y B), pero no en HeLa-RpACE2 (Fig. 6C). Curiosamente, el pseudovirus empaquetado con una proteína CS, VIH/CS14-608, mostró un nivel de actividad luciferasa similar al de VIH/ BJ01-S (Fig. 6A). Como se esperaba de los análisis de Western blot y EM antes mencionados, el VIH/CS424-494, en el que el RBM de BJ01-S se transfirió al esqueleto de Rp3-S, no produjo actividad luciferasa por encima del nivel de fondo en ninguno de las tres líneas celulares HeLa que expresan ACE2.

 

Mapeo de la región BJ01-S mínima requerida para convertir la Rp3-S que no se une a ACE2 en una proteína S quimérica que se une a ACE2.

En base a los resultados mencionados anteriormente, es evidente que la proteína Rp3-S es capaz de mediar la entrada celular siempre que el componente de unión a ACE2 se incorpore en la región N-terminal de su molécula. Para definir la región mínima requerida para esta conversión de la unión que no es de huACE2 a la unión de huACE2, se construyó una serie de proteínas CS y las ubicaciones exactas de los aminoácidos se resumen en la Fig. 7A. La expresión de la proteína S en células 293T y su incorporación en pseudovirus para cada construcción se analizaron mediante transferencia Western usando anticuerpos específicos de S y específicos de p24 como se describió anteriormente (Fig. 7B). Aunque los niveles de expresión de la proteína S fueron similares para todas las construcciones, se observaron diferencias significativas en la incorporación. La proteína S era indetectable en pseudovirus derivados de CS371-608 y solo se detectó débilmente para las quimeras CS310-608, CS45-608 y CS310-518. Se examinaron las infectividades de todas las construcciones CS en HeLa-huACE2 y se hicieron varias observaciones (Fig. 7C). Con la excepción de las quimeras CS417-608 y CS371-608, que produjeron un nivel de fondo de actividad luciferasa, todas las quimeras exhibieron niveles significativos de actividad luciferasa, lo que sugiere que los pseudovirus que contienen estas proteínas CS pudieron usar huACE2 para la entrada celular. A partir de estos resultados, se dedujo que la región de aa 310 a 518 de BJ01-S era necesaria y suficiente para convertir Rp3-S en una molécula de unión a huACE2. Para CS310-608, CS45-608 y CS310-518, los niveles de actividad luciferasa detectados fueron mucho más altos que los pronosticados a partir del nivel de proteína S incorporada en el virión, lo que sugiere que el ensayo de infección es más sensible que la transferencia Western. También es importante señalar que, aunque un nivel bajo de proteína S estaba presente en el virión de CS417-608, no condujo a una infección productiva.

 

Discusión

Las glicoproteínas de pico de CoV son responsables del reconocimiento del receptor celular, el tropismo celular y la especificidad del hospedador (7, 9, 19, 25a). Nuestros resultados anteriores mostraron que los SL-CoV identificados en los murciélagos son similares al SARS-CoV en la secuencia y organización del genoma. La diferencia clave entre estos dos grupos de virus estrechamente relacionados radica en sus secuencias de proteína S, específicamente, el RBM, en el que hay dos deleciones en las secuencias de murciélago SL-CoV S (29). A partir de estudios publicados anteriormente que indicaban la importancia del ajuste estructural entre el receptor ACE2 y la proteína S de las variantes del SARS-CoV y la sensibilidad de las proteínas S a mutaciones puntuales en la región RBM, se especuló que es poco probable que SL-CoV S utilice ACE2 como receptor para la entrada de células a menos que el homólogo de ACE2 de murciélago sea significativamente diferente de los de otros mamíferos.

Para abordar estas preguntas sin respuesta, clonamos y expresamos el gen ACE2 de R. pearsonii de murciélago y examinamos las capacidades de las proteínas ACE2 de humanos, civeta de palma y R. pearsonii para apoyar la infección por pseudovirus basados ​​en VIH que contienen diferentes construcciones de proteína S. Nuestros resultados indicaron que la proteína SL-CoV (Rp3) S de murciélago no puede usar ACE2 para la entrada celular independientemente del origen de la molécula de ACE2. También demostramos que el SARS-CoV S humano no puede utilizar bat RpACE2 como receptor funcional. Por otro lado, demostramos que después de la sustitución de un pequeño segmento (aa 310 a 518) de Rp3-S por la secuencia análoga de BJ01-S, la proteína CS imita la función de BJ01-S con respecto al uso del receptor en el Sistema de ensayo de pseudovirus del VIH. Aunque actualmente no tenemos forma de confirmar que la proteína Rp3-S sea funcional en la unión de su receptor afín debido a la falta de una línea celular de murciélago de herradura, nuestro análisis de construcción quimérica sugiere que el gen Rp3-S estaba intacto y sería funcional si se identificara un receptor apropiado. También vale la pena señalar que, aunque no tenemos datos experimentales para demostrar la unión directa de diferentes proteínas S a huACE2 en la superficie de la célula HeLa, confirmamos que los anticuerpos policlonales anti-huACE2 o anti-SARS-CoV fueron capaces de neutralizar la infección para diferentes pseudovirus (datos no mostrados).

El significado de estos hallazgos es el siguiente. En primer lugar, el hecho de que la proteína SARS-CoV S no utilice bat RpACE2 como receptor sugiere que, a pesar de la presencia de un grupo diverso de SL-CoV en los murciélagos herradura, es poco probable que sean el reservorio natural del virus progenitor inmediato del SARS-CoV. Por lo tanto, es importante continuar la búsqueda del reservorio de SARS-CoV en otras especies de murciélagos y vida silvestre. También es importante realizar estas búsquedas en diferentes ubicaciones geográficas porque los mercados de animales vivos en el sur de China obtienen sus animales de toda China y de países extranjeros (26, 29, 39) y es posible que el anfitrión natural del SARS-CoV no era autóctono del sitio del primer brote de SARS. En segundo lugar, como se predijo, la variación de la secuencia en la región N-terminal de la proteína SL-CoV S la hizo incapaz de usar ACE2 como receptor para la entrada celular. Sin embargo, la actividad de unión a ACE2 de los SL-CoV se adquirió fácilmente mediante el reemplazo de un segmento de secuencia relativamente pequeño de la proteína S de la secuencia S del SARS-CoV, lo que destaca los peligros potenciales que presenta este grupo diverso de virus en los murciélagos. Ahora está bien documentado que las especies de murciélagos, incluidos los murciélagos de herradura, pueden infectarse con diferentes CoV. También se ha observado la coinfección por diferentes CoV en un murciélago individual (26, 29, 39). Conociendo la capacidad de diferentes CoV para recombinarse tanto en el laboratorio (2, 14, 15, 32) como en la naturaleza (22, 41, 44), la posibilidad de que los SL-CoV adquieran la capacidad de infectar células humanas adquiriendo secuencias S competentes para unirse a ACE2 u otras proteínas de superficie de células humanas se pueden prever fácilmente. Esto podría ocurrir si las mismas células de murciélago portan receptores para ambos tipos de virus. En este contexto, se podría concluir que es poco probable que la especie de murciélago de herradura en particular investigada en el estudio actual sea el huésped de mezcla putativo. Sin embargo, no se puede descartar la posibilidad de que un murciélago de herradura diferente o una especie de murciélago diferente pueda tener un ACE2 funcional, lo que le da la capacidad de actuar como anfitrión de mezcla.

Nuestros resultados indicaron que la estructura general de la proteína SL-CoV S es muy similar a la de la proteína SARS-CoV S. Queda por ver si un SL-CoV recombinante que contiene una proteína CS (por ejemplo, CS14-608) será capaz de infectar animales experimentales y causar enfermedades. Dichos estudios serán importantes para dilucidar el mecanismo molecular de patogénesis del SARS-CoV y virus relacionados. El resultado de dicha investigación también será invaluable para formular estrategias de control de posibles brotes futuros causados ​​por virus que son similares, pero diferentes, a los SARS-CoV responsables de los brotes de 2002-2003.

La RBM de la proteína SARS-CoV S se ha localizado entre los aa 424 y 494 mediante la reconstrucción de la estructura cristalina y los estudios funcionales (27). Cuando esta región sola se usó para reemplazar la secuencia afín en la proteína SL-CoV S, la proteína quimérica (CS427-494) no pudo incorporarse en el pseudovirus a un nivel detectable por transferencia Western. Se obtuvieron resultados similares para algunas otras construcciones de CS. Es interesante que estas construcciones de CS sean similares a otras en que la mutagénesis de quimerización se localizó exclusivamente en el ectodominio. Por tanto, el fracaso de la incorporación se debió muy probablemente a cambios conformacionales que impidieron el plegamiento adecuado y la presentación de la superficie celular de las proteínas quiméricas. No está claro en esta etapa si estas construcciones pueden incorporarse funcionalmente en un sistema de pseudovirus diferente, como el sistema del virus de la estomatitis vesicular (16). Al mismo tiempo, también teníamos construcciones de CS que mostraban niveles muy bajos de incorporación al virus pero un nivel significativo de actividad luciferasa o infección (por ejemplo, CS45-608). Esto sugiere que puede no haber una correlación directa entre la eficiencia de la incorporación y la entrada de la celda, lo que aboga por una mayor investigación de estos constructos utilizando diferentes sistemas.

La proteína RpACE2 está compuesta por 805 aa, el mismo número que huACE2, y el nivel de conservación de la secuencia entre estas dos proteínas ACE2 es significativo, con un 81% de identidad de secuencia y un 90% de similitud. Varios estudios publicados han identificado una serie de residuos en huACE2 que son importantes para la interacción S-ACE2 (20, 27, 31). A partir del análisis de la estructura cristalina de un complejo ACE2-S (20, 27, 31), se han identificado 18 residuos de aminoácidos en contacto directo con la proteína SARS-CoV S. Entre ellos, solo siete son diferentes en RpACE2 (Fig. 1). Se ha demostrado que los residuos Tyr-41 y Lys-353 interactúan con los residuos de aminoácidos de las proteínas SARS-CoV S que son más sensibles en la interacción S-ACE2 (20, 27, 31). Dado que Lys-353 se conserva en RpACE2, sería interesante ver si el cambio de Tyr-a-His (T41H) en RpACE2 fue el principal responsable de la incapacidad para actuar como receptor del SARS-CoV. Debe enfatizarse que, además de la variación de la secuencia de aminoácidos, también existen diferencias en los números y ubicaciones de los sitios de glicosilación N potenciales entre huACE2 y RpACE2 (Fig. 1). Queda por ver si los diferentes patrones de glicosilación también juegan un papel en la utilización de proteínas ACE2 de diferentes especies por los SARS-CoV.

Se ha identificado a los murciélagos como reservorios naturales de muchos virus zoonóticos emergentes, como el virus Hendra, el virus Nipah y los lyssavirus (6). Aunque es necesario un huésped intermedio para amplificar la mayoría de los virus de los murciélagos y entregarlos a las poblaciones humanas, se ha demostrado que el virus Nipah en Bangladesh es capaz de transmisión directa de murciélago a humano (revisado en la referencia 13). Desde el descubrimiento de SL-CoV en murciélagos, se ha descubierto un gran número de CoV en diferentes especies de murciélagos (26, 29, 35, 39, 43, 44a). Ahora está claro que los murciélagos son reservorios de un grupo diverso de CoV. Teniendo en cuenta las observaciones documentadas de coinfección de la misma especie de murciélago por diferentes CoV, los mismos CoV que infectan diferentes especies de murciélagos (26, 29, 39), la alta densidad de hábitats de murciélagos y la propensión a la recombinación genética entre diferentes CoV, no es Es irrazonable concluir que los murciélagos son un recipiente de mezcla natural para la creación de nuevos CoV y que es solo cuestión de tiempo antes de que algunos de ellos crucen las barreras de especies y se conviertan en mamíferos terrestres y poblaciones humanas. Los hallazgos presentados en este estudio sirven como el primer ejemplo de cambio de host que se puede lograr para G2b CoV en condiciones de laboratorio mediante el intercambio de un segmento de secuencia relativamente pequeño entre estos CoV previamente desconocidos.

 

 

FIG. 1. Alineación de múltiples secuencias de aminoácidos de las regiones N-terminales (aa 1 a 400) de diferentes proteínas ACE2. La alineación de la secuencia se realizó utilizando el programa Clustal W (39a). Los sitios de glicosilación N potenciales se indican mediante el signo # encima de los residuos de asparagina correspondientes (N). Los asteriscos indican los residuos de aminoácidos cruciales que están implicados en el contacto directo entre huACE2 y la proteína SARS-CoV S. Los números de acceso para las proteínas ACE2 son los siguientes: humano, NM 021804; civeta de palma, AY881174; RpACE2, EF569964; ratón, NM 027286; y rata, NM 001012006. Sombreado negro, 100% de identidad; sombreado gris, 75% de identidad.

 

FIG. 2. Análisis de transferencia Western de bat ACE2 (RpACE2) expresado en células HeLa usando anticuerpos anti-RpACE2 de conejo. Carril 1, lisado de células HeLa usado como control negativo; carriles 2 a 4, lisados ​​de HeLa-huACE2, HeLa-pcACE2 y HeLa-RpACE2, respectivamente. A la izquierda se dan las masas moleculares (en kDa) de los marcadores proteicos teñidos previamente (Fermentas, Canadá).

 

 

FIG. 3. Detección de la expresión de ACE2 mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia. Las células se incubaron con anticuerpo anti-huACE2 de cabra, seguido de sondeo con IgG anti-cabra de burro conjugado con FITC. Las tres filas superiores (de arriba hacia abajo) muestran células HeLa que expresan huACE2, pcACE2 y RpACE2. La fila inferior muestra las células HeLa como control negativo. Las columnas (de izquierda a derecha) muestran tinción de ACE2 expresada (fluorescencia verde de FITC), tinción de núcleos celulares (fluorescencia azul de Hoechst 33258) y la imagen combinada de doble tinción.

 

FIG. 4. Determinación de la actividad de ACE2. Las actividades de proteasa de diferentes fracciones de la membrana celular que expresan ACE2 se determinaron utilizando el sustrato específico de ACE2 QFS (ver Materiales y métodos). Se muestra la fluorescencia liberada (en unidades de fluorescencia relativa [RFU]) determinada a 320 a 420 nm en ausencia (A) y presencia (B) de EDTA. Como controles negativos se utilizaron células HeLa sin gen ACE2 exógeno y tampón PBS. Las barras de error indican las desviaciones estándar.

 

 

FIG. 5. Análisis de la expresión e incorporación de la proteína S en pseudovirus. (A) Análisis de transferencia Western. Las proteínas S expresadas en células 293T transfectadas se sondaron con MAb F26G8 o S-MAb (arriba); los paneles central e inferior son transferencias Western de pseudovirus sedimentados usando MAbs F26G8 y p24, respectivamente. (B) examen EM de la morfología del pseudovirus. El nombre de la construcción de la proteína S en cada pseudovirus se muestra en la esquina superior izquierda de la micrografía electrónica.

 

 

FIG. 6. Medición de la infectividad de pseudovirus determinando la actividad de luciferasa informadora. Los lisados ​​celulares se prepararon 48 h p.i. de HeLa-huACE2 (A), HeLa-pcACE2 (B) y HeLa-RpACE2 (C), y se determinó la actividad luciferasa como se describe en Materiales y métodos. Las barras de error indican las desviaciones estándar.

 

 

FIG. 7. Construcción y análisis funcional de pseudovirus derivados de diferentes construcciones de proteína CS. (A) Presentación esquemática de construcciones de proteína S SARS-CoV S humana (BJ01-S), SL-CoV S de murciélago (Rp3-S) y diferentes proteínas CS. Los números en los subíndices indican las ubicaciones de aminoácidos de las secuencias de BJ01-S utilizadas para reemplazar la región correspondiente de Rp3-S. El cuadro abierto indica la ubicación de la RBM. TPA, péptido señal del activador del plasminógeno tisular; TM, dominio transmembrana derivado de la proteína de fusión del virus Sendai. (B) Análisis de transferencia Western. Las proteínas S en las células 293T transfectadas (arriba) o los pseudovirus purificados (en el medio) se sondaron con MAb F26G8 (S-MAb); en la parte inferior hay una transferencia de diferentes pseudovirus probados con p24 MAb como control para determinar la cantidad relativa de pseudovirus del VIH para cada construcción. (C) Medición de la infectividad de pseudovirus determinando la actividad luciferasa. Los lisados ​​celulares se prepararon 48 h p.i. de HeLa-huACE2 infectado con pseudovirus que contienen diferentes proteínas S como se indica debajo del gráfico de barras. Las barras de error indican las desviaciones estándar.

 

Agradecimientos

Agradecemos a Bryan Eaton por la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Rongge Yang por proporcionar amablemente el p24 MAb.

Este trabajo fue financiado conjuntamente por un Programa Estatal Clave para la Subvención de Investigación Básica (2005CB523004) del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China, un fondo especial del presidente de la Academia de Ciencias de China (n.° 1009), el Proyecto Clave del Programa de Innovación del Conocimiento de la Academia de Ciencias de China (KSCX1-YW-R-07) ​​a Z. Shi, el Sexto Programa Marco "EPISARS" de la Comisión Europea, una subvención grupal de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China para la Investigación Creativa (30421004) a H. Deng y el CRC de Bioseguridad de Australia para Enfermedades Infecciosas Emergentes (proyecto 1.026RE) a L.-F. Wang.

 

Referencias

1.Babcock, G. J., D. J. Esshaki, W. D. Thomas, Jr., and D. M. Ambrosino. 2004. Amino acids 270 to 510 of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein are required for interaction with receptor. J. Virol. 78: 4552-4560.

2. Baric, R. S., K. Fu, M. C. Schaad, and S. A. Stohlman. 1990. Establishing a genetic recombination map for murine coronavirus strain A59 complementation groups. Virology 177: 646-656.

3. Berry, J. D., S. Jones, M. A. Drebot, A. Andonov, M. Sabara, X. Y. Yuan, H. Weingartl, L. Fernando, P. Marszal, J. Gren, B. Nicolas, M. Andonova, F. Ranada, M. J. Gubbins, T. B. Ball, P. Kitching, Y. Li, A. Kabani, and F. Plummer. 2004. Development and characterisation of neutralising monoclonal antibody to the SARS-coronavirus. J. Virol. Methods 120: 87-96.

4. Bosch, B. J., R. van der Zee, C. A. de Haan, and P. J. Rottier. 2003. The coronavirus spike protein is a class I virus fusion protein: structural and functional characterization of the fusion core complex. J. Virol. 77: 8801-8811.

5.Reference deleted.

6. Calisher, C. H., J. E. Childs, H. E. Field, K. V. Holmes, and T. Schountz. 2006. Bats: important reservoir hosts of emerging viruses. Clin. Microbiol. Rev. 19: 531-545.

7. Casais, R., B. Dove, D. Cavanagh, and P. Britton. 2003. Recombinant avian infectious bronchitis virus expressing a heterologous spike gene demonstrates that the spike protein is a determinant of cell tropism. J. Virol. 77: 9084-9089.

8.Reference deleted.

9. de Haan, C. A., L. Kuo, P. S. Masters, H. Vennema, and P. J. Rottier. 1998. Coronavirus particle assembly: primary structure requirements of the membrane protein. J. Virol. 72:6838-6850.

10. Dimitrov, D. S. 2004. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nat. Rev. Microbiol. 2: 109-122.

11. Douglas, G. C., M. K. O'Bryan, M. P. Hedger, D. K. Lee, M. A. Yarski, A. I. Smith, and R. A. Lew. 2004. The novel angiotensin-converting enzyme (ACE) homolog, ACE2, is selectively expressed by adult Leydig cells of the testis. Endocrinology 145: 4703-4711.

12.Drosten, C., S. Gunther, W. Preiser, S. van der Werf, H. R. Brodt, S. Becker, H. Rabenau, M. Panning, L. Kolesnikova, R. A. Fouchier, A. Berger, A. M. Burguiere, J. Cinatl, M. Eickmann, N. Escriou, K. Grywna, S. Kramme, J. C. Manuguerra, S. Muller, V. Rickerts, M. Sturmer, S. Vieth, H. D. Klenk, A. D. Osterhaus, H. Schmitz, and H. W. Doerr. 2003. Identification of a novel coronavirus in patients with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 348: 1967-1976.

13. Eaton, B. T., C. C. Broder, D. Middleton, and L. F. Wang.2006. Hendra and Nipah viruses: different and dangerous. Nat. Rev. Microbiol. 4: 23-35.

14. Fu, K., and R. S. Baric. 1992. Evidence for variable rates of recombination in the MHV genome. Virology 189: 88-102.

15. Fu, K., and R. S. Baric. 1994. Map locations of mouse hepatitis virus temperature-sensitive mutants: confirmation of variable rates of recombination. J. Virol. 68:7 458-7466.

16. Fukushi, S., T. Mizutani, M. Saijo, S. Matsuyama, N. Miyajima, F. Taguchi, S. Itamura, I. Kurane, and S. Morikawa. 2005. Vesicular stomatitis virus pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein. J. Gen. Virol. 86: 2269-2274.

17. Gorbalenya, A. E., E. J. Snijder, and W. J. Spaan. 2004. Severe acute respiratory syndrome coronavirus phylogeny: toward consensus. J. Virol. 78: 7863-7866.

18. Guan, Y., B. J. Zheng, Y. Q. He, X. L. Liu, Z. X. Zhuang, C. L. Cheung, S. W. Luo, P. H. Li, L. J. Zhang, Y. J. Guan, K. M. Butt, K. L. Wong, K. W. Chan, W. Lim, K. F. Shortridge, K. Y. Yuen, J. S. Peiris, and L. L. Poon. 2003. Isolation and characterization of viruses related to the SARS coronavirus from animals in southern China. Science 302: 276-278.

19. Haijema, B. J., H. Volders, and P. J. Rottier. 2003. Switching species tropism: an effective way to manipulate the feline coronavirus genome. J. Virol. 77: 4528-4538.

20. Han, D. P., A. Penn-Nicholson, and M. W. Cho. 2006. Identification of critical determinants on ACE2 for SARS-CoV entry and development of a potent entry inhibitor. Virology 350: 15-25.

21. Reference deleted.

22. Jia, W., K. Karaca, C. R. Parrish, and S. A. Naqi. 1995. A novel variant of avian infectious bronchitis virus resulting from recombination among three different strains. Arch. Virol. 140: 259-271.

23. Kan, B., M. Wang, H. Jing, H. Xu, X. Jiang, M. Yan, W. Liang, H. Zheng, K. Wan, Q. Liu, B. Cui, Y. Xu, E. Zhang, H. Wang, J. Ye, G. Li, M. Li, Z. Cui, X. Qi, K. Chen, L. Du, K. Gao, Y. T. Zhao, X.-Z. Zou, Y.-J. Feng, Y.-F. Gao, R. Hai, D. Yu, Y. Guan, and J. Xu. 2005. Molecular evolution analysis and geographic investigation of severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in palm civets at an animal market and on farms. J. Virol. 79: 11892-11900.

24.Krueger, D. K., S. M. Kelly, D. N. Lewicki, R. Ruffolo, and T. M. Gallagher. 2001. Variations in disparate regions of the murine coronavirus spike protein impact the initiation of membrane fusion. J. Virol. 75: 2792-2802.

25. Ksiazek, T. G., D. Erdman, C. S. Goldsmith, S. R. Zaki, T. Peret, S. Emery, S. Tong, C. Urbani, J. A. Comer, W. Lim, P. E. Rollin, S. F. Dowell, A. E. Ling, C. D. Humphrey, W. J. Shieh, J. Guarner, C. D. Paddock, P. Rota, B. Fields, J. DeRisi, J. Y. Yang, N. Cox, J. M. Hughes, J. W. LeDuc, W. J. Bellini, and L. J. Anderson. 2003. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med. 348: 1953-1966.

25a. Kuo, L., G. J. Godeke, M. J. Raamsman, P. S. Masters, and P. J. Rottier. 2000. Retargeting of coronavirus by substitution of the spike glycoprotein ectodomain: crossing the host cell species barrier. J. Virol. 74: 1393-1406.

26. Lau, S. K., P. C. Woo, K. S. Li, Y. Huang, H. W. Tsoi, B. H. Wong, S. S. Wong, S. Y. Leung, K. H. Chan, and K. Y. Yuen. 2005. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-like virus in Chinese horseshoe bats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 14040-14045.

27. Li, F., W. Li, M. Farzan, and S. C. Harrison.2005. Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science 309: 1864-1868.

28. Li, W., M. J. Moore, N. Vasilieva, J. Sui, S. K. Wong, M. A. Berne, M. Somasundaran, J. L. Sullivan, K. Luzuriaga, T. C. Greenough, H. Choe, and M. Farzan. 2003. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426: 450-454.

29. Li, W., Z. Shi, M. Yu, W. Ren, C. Smith, J. H. Epstein, H. Wang, G. Crameri, Z. Hu, H. Zhang, J. Zhang, J. McEachern, H. Field, P. Daszak, B. T. Eaton, S. Zhang, and L. F. Wang. 2005. Bats are natural reservoirs of SARS-like coronaviruses. Science 310: 676-679.

30. Li, W., S. K. Wong, F. Li, J. H. Kuhn, I. C. Huang, H. Choe, and M. Farzan. 2006. Animal origins of the severe acute respiratory syndrome coronavirus: insight from ACE2-S-protein interactions. J. Virol. 80: 4211-4219.

31. Li, W., C. Zhang, J. Sui, J. H. Kuhn, M. J. Moore, S. Luo, S. K. Wong, I. C. Huang, K. Xu, N. Vasilieva, A. Murakami, Y. He, W. A. Marasco, Y. Guan, H. Choe, and M. Farzan. 2005. Receptor and viral determinants of SARS-coronavirus adaptation to human ACE2. EMBO J. 24: 1634-1643.

32. Lissenberg, A., M. M. Vrolijk, A. L. van Vliet, M. A. Langereis, J. D. de Groot-Mijnes, P. J. Rottier, and R. J. de Groot.2005. Luxury at a cost? Recombinant mouse hepatitis viruses expressing the accessory hemagglutinin esterase protein display reduced fitness in vitro. J. Virol. 79: 15054-15063.

33. Martina, B. E., B. L. Haagmans, T. Kuiken, R. A. Fouchier, G. F. Rimmelzwaan, G. Van Amerongen, J. S. Peiris, W. Lim, and A. D. Osterhaus. 2003. Virology: SARS virus infection of cats and ferrets. Nature 425: 915.

34. Nie, Y., G. Wang, X. Shi, H. Zhang, Y. Qiu, Z. He, W. Wang, G. Lian, X. Yin, L. Du, L. Ren, J. Wang, X. He, T. Li, H. Deng, and M. Ding.2004. Neutralizing antibodies in patients with severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus infection. J. Infect. Dis. 190: 1119-1126.

35. Poon, L. L., D. K. Chu, K. H. Chan, O. K. Wong, T. M. Ellis, Y. H. Leung, S. K. Lau, P. C. Woo, K. Y. Suen, K. Y. Yuen, Y. Guan, and J. S. Peiris.2005. Identification of a novel coronavirus in bats. J. Virol. 79: 2001-2009.

36. Poutanen, S. M., D. E. Low, B. Henry, S. Finkelstein, D. Rose, K. Green, R. Tellier, R. Draker, D. Adachi, M. Ayers, A. K. Chan, D. M. Skowronski, I. Salit, A. E. Simor, A. S. Slutsky, P. W. Doyle, M. Krajden, M. Petric, R. C. Brunham, and A. J. McGeer. 2003. Identification of severe acute respiratory syndrome in Canada. N. Engl. J. Med. 348:1995-2005.

37. Qu, X. X., P. Hao, X. J. Song, S. M. Jiang, Y. X. Liu, P. G. Wang, X. Rao, H. D. Song, S. Y. Wang, Y. Zuo, A. H. Zheng, M. Luo, H. L. Wang, F. Deng, H. Z. Wang, Z. H. Hu, M. X. Ding, G. P. Zhao, and H. K. Deng. 2005. Identification of two critical amino acid residues of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein for its variation in zoonotic tropism transition via a double substitution strategy. J. Biol. Chem. 280: 29588-29595.

38. Ren, W., W. Li, M. Yu, P. Hao, Y. Zhang, P. Zhou, S. Zhang, G. Zhao, Y. Zhong, S. Wang, L. F. Wang, and Z. Shi.2006. Full-length genome sequences of two SARS-like coronaviruses in horseshoe bats and genetic variation analysis. J. Gen. Virol. 87: 3355-3359.

39. Tang, X. C., J. X. Zhang, S. Y. Zhang, P. Wang, X. H. Fan, L. F. Li, G. Li, B. Q. Dong, W. Liu, C. L. Cheung, K. M. Xu, W. J. Song, D. Vijaykrishna, L. L. Poon, J. S. Peiris, G. J. Smith, H. Chen, and Y. Guan. 2006. Prevalence and genetic diversity of coronaviruses in bats from China. J. Virol. 80: 7481-7490.

39a. Thompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680.

40. Tu, C., G. Crameri, X. Kong, J. Chen, Y. Sun, M. Yu, H. Xiang, X. Xia, S. Liu, T. Ren, Y. Yu, B. T. Eaton, H. Xuan, and L. F. Wang. 2004. Antibodies to SARS coronavirus in civets. Emerg. Infect. Dis. 10: 2244-2248.

41. Wang, L., D. Junker, and E. W. Collisson.1993. Evidence of natural recombination within the S1 gene of infectious bronchitis virus. Virology 192: 710-716.

42. Wang, P., J. Chen, A. Zheng, Y. Nie, X. Shi, W. Wang, G. Wang, M. Luo, H. Liu, L. Tan, X. Song, Z. Wang, X. Yin, X. Qu, X. Wang, T. Qing, M. Ding, and H. Deng. 2004. Expression cloning of functional receptor used by SARS coronavirus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 315: 439-444.

42a. Wong, S. K., W. H. Li, M. J. Moore, H. Choe, and M. Farzan.2004. A 193-amino acid fragment of the SARS coronavirus S protein efficiently binds angiotensin-converting enzyme 2. J. Biol. Chem. 279: 3197-3201.

43. Woo, P. C., S. K. Lau, K. S. Li, R. W. Poon, B. H. Wong, H. W. Tsoi, B. C. Yip, Y. Huang, K. H. Chan, and K. Y. Yuen. 2006. Molecular diversity of coronaviruses in bats. Virology 351: 180-187.

44. Woo, P. C., S. K. Lau, C. C. Yip, Y. Huang, H. W. Tsoi, K. H. Chan, and K. Y. Yuen.2006. Comparative analysis of 22 coronavirus HKU1 genomes reveals a novel genotype and evidence of natural recombination in coronavirus HKU1. J. Virol. 80: 7136-7145.

44a. P. C. Y. Woo, M. Wang, S. K. P. Lau, H. Xu, R. W. S. Poon, R. Guo, B. H. L. Wong, K. Gao, H.-W. Tsoi, Y. Huang, K. S. M. Li, C. S. F. Lam, K.-H. Chan, B.-J. Zheng, and K.-Y. Yuen. 2007. Comparative analysis of twelve genomes of three novel group 2c and group 2d coronaviruses reveals unique group and subgroup features. J. Virol. 81: 1574-1585.

45. Xiao, X., S. Chakraborti, A. S. Dimitrov, K. Gramatikoff, and D. S. Dimitrov.2003. The SARS-CoV S glycoprotein: expression and functional characterization. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312: 1159-1164.

46. Zhang, H., G. Wang, J. Li, Y. Nie, X. Shi, G. Lian, W. Wang, X. Yin, Y. Zhao, X. Qu, M. Ding, and H. Deng. 2004. Identification of an antigenic determinant on the S2 domain of the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein capable of inducing neutralizing antibodies. J. Virol. 78: 6938-6945.

 

Publicado en Journal of Virology, Vol. 82  N° 4, Febrero de 2008, pag.  1899-1907.